No ha incluido el análisis de la secuencia, el trabajo no tiene referencias,luego las incluye al final pero..... ANÁLISIS DE “DRUG RESISTANCE EFFLUX PROTEIN “ DE RHODOCOCCUS
iNGENIERÍA GENÉTICA DE MICROORGANISMOS
uNIVERSIDAD DE LEÓN
cRISTINA fERNÁNDEZ dÍEZ
Resumen: Rhodococcus (los nombres de especies "cursiva") es un microorganismo que se adapta fácilmente a medios adversos y diversos por eso esta ampliamente distribuido y pertenece al grupo de los Actinomycetales?????, teniendo estructura bacilar. Son un grupo de microorganismos que no esporulan y que no son móviles. Se secuenció el género (se secuencia una especie, no un género) en el 2006 (falta una referencia) conteniendo 9.7Mpb y contiene tres plásmidos lineales.
Se caracteriza a demás por su rápida velocidad de crecimiento y su ciclo de vida sencillo. (referencia)
Es un microorganismo Gram positivo que contiene varias especies entre las que se encuentra R. equi que produce enfermedades en los humanos, aunque la mayoría no son perjudiciales.
Rhodococcus es un género importante por su capacidad para catabolizar una gran gama de compuestos bioactivos, producir esteroides y participar en la formación de combustibles fósiles
Es un género que también se encarga de la biodegradación de contaminantes organicos.
El marco de lectura escogido corresponde a una drug resistance efflux protein que al parecer es una proteína trasmembrana que es resistente ante las sustancias extrañas ??????, fármacos o drogas que pueden alterar el funcionamiento normal de la célula. La proteína es tiene un alto contenido en G+C (las proteínas no tiene alto ni bajo contenido en G+C)
INTRODUCCIÓN:(faltan referencias, no se puede escribir un trabajo sin referencias) Rhodococcus (cursiva) es un género que pertenece a la familia (orden) de los Actinomicetales , son un subgrupo de las bacterias que tienen ácidos micólicos en la pared celular y se ha podido comprobar que tienen relación filogenética con otros géneros como Mycobacterium (cursiva) y Corynobacterium ( Corynebacterium y en cursiva) entre otras, a partir del RNA ribosomal 16S. (Gráfica1) Varias especies han sido descritas a partir de las características de su membrana (????????) incluyendo genes implicados en la virulencia, en la degradación metabólica, análisis genéticos y organización de operones entre otros. Según estos datos las diferentes especies que se engloban en este género son: R. rhodochrous que incluye a R. bronchialis, , R. corallinus, R. equi, R. erythropolis, R. ruber, R. rubropertinctus y R. térrea, R. coprophilus. (todos los nombres deben ir en cursiva) Los microorganismos que pertenecen al género Rhodococcus (cursiv) están generalmente muy distribuidos por el medio ambiente pudiéndose encontrar también en suelos, reservorios de agua, ríos y otros ambientes acuáticos.
Algunos microorganismos que pertenecen a éste género son capaces de generar enfermedades en los humanos, por lo que pueden ser considerados patógenos oportunistas.
Características generales del género:(referencias?)
Microorganismos Gram positivos en cuya pared celular está compuesta principalmente por péptido glucano que rodea a la membrana citoplasmática. También encontramos ácidos teitoícos que se unen covalentemente con el péptido glucano.
Alto contenido en G+C (67-73%)
Crecen bien a temperaturas en torno a los 30-37ºC
Son bacterias agrupadas de forma bacilar a partir de la fragmentación de un filamento vegetativo ramificado.
Tienen colonias mucosoas, lisas o rugosas de varios colores e incluso incoloras, pero estas sulen ser variantes de las células parentales.
Sensibles a lisozima
Catalasas positivas
Metabolismo oxidativo de los carbohidratos.
Fosfolípidos principales:
Disfosfatidil glicerol
Fosfatidil etanolamina
Fosfatidilinositol dimanósido
(Hubiera sido conveniente hacer referencia a las caracteristicas del género definidas en el Bergey)
MATERIALES Y MÉTODOS: Necesitamos, para empezar a trabajar, un plasmado ( plásmido?????) suicida que no puede replicarse en el huésped, como es el pOJ260 ( Imagen 1), es un plásmido de E. coli.
Así mismo también es necesario tener la secuencia de la proteína elegida para poder llevar a cabo los diferentes experimentos que nos indicarán finalmente la procedencia de la misma, su localización función etc,. (Imagen 3)
(materiales y métodos muy escasos) Análisis del gen que codifica para la proteína elegida:
AMPLIFICACIÓN DEL GEN POR PCR:
Para ello necesitamos la secuencia de nucleótidos del gen para diseñar un primer directo a partir del extremo 5’ de la cadena complementaria y otro a partir del extremo 3’ de la cadena molde, pero a esta última, le damos la vuelta para hacerla en sentido 5’- 3’ y le quitamos el codón de stop(no lo tiene claro, se quita el codon de STOP para hacer una fusión génica) para que se pueda leer el primer completo.
A esta amplificación le tenemos que poner sitios de corte para que el fragmento amplificado se pueda clonar en el plásmido suicida (si clona el gen en un plasmido suicida, no entiendo que va a hacer luego con él) que hemos elegido. En este caso ponemos sitios de corte con la enzima Hind III que pertenece a la región de clonación múltiple del plásmido suicida elegido. (Diseño 1)
AMPLIFICACIÓN DE FRAGMENTOS INTERNOS DEL GEN :
Para clonar un fragmento interno del gen lo primero que necesitamos es saber cuales pueden ser los mejores primers. Para averiguarlo nosotros utilizamos un programa informático (¿qué programa?) que estadísticamente te señala la mejor probabilidad, a parte de darte otras opciones.
De la misma manera también nos indica la temperatura de los oligonucleótidos(temperatura de fusión) , su contenido en G+C y su tamaño.
Como el fragmento interno lo tenemos que introducir en el plásmido suicida les ponemos a los primers sitios de corte en los extremos 5’ que se corresponden a la enzima Eco RI para que el fragmento pueda ser clonado en el sitio de clonación múltiple del plásmido suicida. (Diseño 2)
DELECCIÓN DE UN FRAGMENTO INTERNO DEL GEN:(para qué va a hacer esto????) )
Para realizar la delección tenemos que quitar un número múltiplo de tres nucleótidos para que se pueda formar después RNAm que permita que se siga expresando el gen de abajo. Nosotros le hemos quitado un fragmento de 120 nucleótidos en la posición (781-901). Los primer que tenemos que realizar son cuatro, el primero y el segundo se realizan de forma habitual y el segundo y el tercero también pero teniendo en cuenta que tienen que estar flanqueando la zona de delección del gen.(Diseño3)
Análisis de la proteína elegida:
AMPLIFICACIÓN DEL GEN CON COLAS DE HISTIDINA
Se utiliza una cola formada por 6 Histidinas para realizar purificaciones de la proteína por cromatografía de afinidad usando metales inmóviles sobre una matriz o por cromatografía con resinas de níquel. La histidina se añade en forma de nucleótidos para que cuando se produzca la traducción de la proteína el aminoácido en cuestión se exprese. Una de las ventajas de esta técnica es que se puede utilizar incluso, aunque el DNA este desnaturalizado y en éste caso podremos eluir la proteína en cuestión con imidazol trabajando con un buffer fisiológico:PBS. Haga el favor de releer estas frases y encontrar los errores.
Las colas de Histidina sólo las colocamos en el extremo 5’ de la cadena molde. Para sacar la proteína del DNA donde esta integrado le ponemos sitios de corte correspondientes a Hin III y así poder purificarlo. (Diseño 4) .
MUTAGÉNESIS DIRIGIDA DEL GEN .
Mutamos un codon de la proteína que estamos tratando en una zona interna de la misma para ver que es lo que ocurre después.Que quiere decir con esta frase???Para ello debemos tener en cuenta que los cambios más significativos se dan con el cambio de la primera y segunda base.
Debemos hacer cuatro primers y uno de ellos mutagénico, es el que va a llevar el cambio de base en su secuencia. Nosotros hemos hecho el cambio para el aminoácido leucina, lo hemos cambiado por la valina: cabiamos la primera base correspondiente con citosina por guanina. Los primers 1y 4 se hacen de forma habitual pero el seguno es el que lleva el cambio de base y el tercero es su complementario.(Diseño 5)
FUSIÓN GÉNICA ENTRE LA PROTEINA Y LA GFP:
La proteína GFP nos va a permitir obtener datos relacionados con su localización, dinámica e interacciones moleculares. Es una proteína que desde su descubrimiento ha sido utilizada en medicina y en investigación en general. Se considera una proteína de fusión porque no tiene función conocida. ????????? Para llevar a cabo el proceso debemos hacer cuatro primers. El segundo debe llevar el inicio del gen del tercer primer y el tercero el inicio del gen del segundo. Es importarte quitar el codon de “stop” del segundo primer para que se puedan leer bien los primers sin que haya ningún paro. (Diseño 6)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN: La proteína drug resistance efflux pertenece a la superfamilia Major Facilitator (Tabla1) que es una de las dos grandes familias de transportadores de membrana.( Fulman N.; Bibi,E. 2009).
Gracias a la fusión realizada entre nuestro gen y la gfp pudimos determinar, mediante irradación con luz ultavioleta, que nuestra proteína es una proteína transmembrana sin péptido líder (Gráfica 2), es una proteína integral que atraviesa la membrana varias veces conteniendo tres dominios principales, de los cuales, dos son hidrofilicos: citosólico y extracitosólico, y otro es hidrófobo, dominio transmembrana de interactuación con la bicapa lipídica.(Imagen 2 y Gráfica 3) Es una proteína relacionada con la inactivación de las drogas, por lo que puede facilitar a la célula que la contenga el crecer en condiciones adversas y muy diversas. Drug-specific efflux (eg that of tetracycline) has been recognised as the major mechanism of resistance to this drug in Gram-negative bacteria. Al realizar la delección de un fragmento interno del gen la proteína pierde su funcionalidad por lo que podemos sacar en conclusión que ese fragmento del gen es el que lleva la responsabilidad de que la proteína sea una molécula resistente al paso de sustacias perjudiciales o fármacos a la célula.Tiene claro el concepto de proteína de reflujo????
Por otra parte al hacer la mutación de una base de un codon que codifica para leuicina la funcionalidad de la proteína no varía aunque el fenotipo de la proteína cambia drásticamente, por lo que habremos alterado la conformación espacial de la mísma.
Adicionalmente también aparecen cepas silvestres que no llevan la mutación. Es cortada por 21 enzimas de restricción modificación de las que menos cortes realizan son CNBr, Lys C, Lys N, NTCB y la prolina endopeptidasa.(Tabla 1). Dentro de las características físico-químicas resaltamos la polaridad positiva en la prueba de Gram(me puede explicar esto????) y su hidrofobidad. (Gráficas 4, 5 y 6). Al hacer la prueba de la proteína coiled-coil dio como resultado negativo, por lo tanto no podemos considerar que nuestra proteína tenga dos cadenas idénticas respecto a la secuencia de aminoácidos de la misma.(Gráfica 7)
DISEÑO DE PRIMERS: El marco de lectura elegido corresponde a la “drug resistance efflux protein”que se encuentra situada entre 3710-5464 nucleótidos de la secuencia completa que corresponde a: Secuencia de aminoácidos:
>PNLQRIYPSGQRRLWWNRGSVVSRRATGRKAHTMTVESLEDEPRVGRREWIGLGVLAAGLSLIVVDGTIVNVSLPVIIDELGLDLTDAQWINSIYSVVFAALLLTAGRLGDRLGRRMLFVAGVVVFIGGSLMAAASESSTALIVARVVQGVGGALVLPCTLSTVNATFRGRDRAIAFGVWGAVISGMAAVGPLLGGWLTTSFTWPWIFLVNVPIGILVIIGAFLTVPETRAKITVPGLDVVGLLLSAIGFGALIFALIEGQTIGWWKPIADLHVFGATWPSTAPISATPVVAAVGVVALIGFVVWERHRARIRYSAILDLGLFRFHTFSWGNCTAMAVAIGEFGLLLVLPLFLVNAYGLSTLGAGYVLAVMALGAFASGAAARHVTARFGSPRTVMLGLALEVVGVLAFALYLRPSSAAWLLALLLAIYGLGLGLASAQLTGTVLVDIPTSESGQGSATQSTVRQLGAALGTAILGTVLSLGLAHALTDRLEPVALPPQVESGLVDSTRDSAGGTIPPIREQGDHGRLGPAGPETADALSEGFADATRWSLFVAAGFLAVGLATATRLQHRRPEDDDAAATATA
Secuencia de nucleótidos(3710/5464):
>ccgaatctgcaacggatttacccgtcggggcagcgtcggctctggtggaatcgcggtagcgtcgtatcgagacgcgccaccgggagaaaggcgcacaccatgaccgtggaatcgctcgaggacgaaccgcgggtaggccgccgggagtggatagggctcggcgtcctcgccgccggtctgtcgctcatcgtcgtcgacggcaccatcgtcaacgtctcgctcccggtgatcatcgacgaactgggtctcgacctcaccgacgcccagtggatcaacagcatctactcggtggtgttcgcagcactgctgctcacggccggccgcctcggcgaccggctgggccgccggatgctcttcgtcgccggtgtcgtcgtgttcatcggcggcagcctgatggcggcggcgtcggagtcctcgacggcgctgatcgtcgcccgcgtcgtgcagggcgtcggcggcgcgctggtgctgccgtgcacgctgtcgacggtcaacgccacgttccgcggacgcgaccgggccatcgcgttcggagtgtggggcgcggtcatctccggcatggcggccgtgggcccgctgctcggcggctggctcacgacgtcgttcacgtggccgtggatcttcctggtgaacgtgccgatcggcatcctcgtcatcatcggcgcgtttctcacggtccccgagacccgggcgaagatcaccgtgcccggactcgacgtggtgggtctgctgctgagcgcaatcggtttcggcgcgttgatcttcgcgctcatcgagggccagaccatcggttggtggaagcccatcgcggatctccacgtgttcggggcgacgtggccgtcgacggcgccgatctcggccaccccggtcgtcgccgccgtcggcgtcgtcgcactcatcggattcgtcgtgtgggagcggcaccgggcgcggatccggtactccgccatcctcgatctggggctcttccggttccacaccttcagctggggcaactgcaccgcgatggcggtcgcgatcggcgagttcggtctgctgctggtgctaccgctgttcctcgtcaacgcgtacgggctcagcacgctgggcgctggctacgtgctcgcggtgatggcgctcggcgcgttcgcgtccggagcggccgcgcgtcacgtcaccgcccgcttcggttccccgcgcaccgtgatgctcggtctggcactcgaggtggtcggcgtcctggcgttcgcgctgtacctgcggccgtcgtcggcggcgtggctgctggcgctgctgctcgcgatctacggcctcgggctggggctcgcgtcggcgcagctcaccggcacggttctcgtcgacatcccgacgtcggagtccggccagggatcggcgacgcagagcacggtccgtcagctgggcgccgcgctgggcactgcaatcctggggaccgtgctctcgctcgggctcgcgcacgccctcaccgaccgcctcgaaccggtggcgctgccgccgcaggtggagtcgggactcgtcgacagcacccgcgactcggccggcggcaccatcccaccgatccgggagcagggcgaccacggcaggctcggcccggccggacccgagaccgccgacgcgctgtccgagggcttcgccgacgccacccgctggtcgctgttcgtcgcggccggattcctcgccgtcggactcgcaaccgccacccgactgcagcaccgacgcccggaggacgacgacgccgcggccaccgccacggcgtag
Imagen 3: Selección de marcos de lectura de la secuencia dada Análisis del gen que codifica para la proteína elegida::
Diseño 1: primers para la amplificación del gen 1 CCGAATCTGCAACGGATTTACCCGTCGGGGCAGCGTCGGCTCTGGTGGAATCGCGGTAGC 1 GGCTTAGACGTTGCCTAAATGGGCAGCCCCGTCGCAGCCGAGACCACCTTAGCGCCATCG
Diseño 3: Delección de un fragmento interno del gen 1 CCGAATCTGCAACGGATTTACCCGTCGGGGCAGCGTCGGCTCTGGTGGAATCGCGGTAGC
1 GGCTTAGACGTTGCCTAAATGGGCAGCCCCGTCGCAGCCGAGACCACCTTAGCGCCATCG
PRIMER 1: 5’-CGGGATCC-ATG-CCGAATCTGCAACGGATTTAC-3’
PRIMER 2: 5’-GGTGTGGAACCGGAAGAGCCCGCCCTCGATGAGCGCGAAGATCAACG-3’
PRIMER 3: 5’- CGTTGATCTTCGCGCTCATCGAGGGCGGGCTCTTCCGGTTCCACACC-3’
PRIMER 4: 5’-CGGGATCCCGCCGTGGCGGT-3’
Sitio de corte Bam HI
Análisis de la proteína: Diseño 4: purificación con colas de histidina 1 CCGAATCTGCAACGGATTTACCCGTCGGGGCAGCGTCGGCTCTGGTGGAATCGCGGTAGC 1 GGCTTAGACGTTGCCTAAATGGGCAGCCCCGTCGCAGCCGAGACCACCTTAGCGCCATCG
Secuencia de drug resistance efflux protein 1 CCGAATCTGCAACGGATTTACCCGTCGGGGCAGCGTCGGCTCTGGTGGAATCGCGGTAGC 1 GGCTTAGACGTTGCCTAAATGGGCAGCCCCGTCGCAGCCGAGACCACCTTAGCGCCATCG
Tabla 1 : Enzimas que cortan la secuencia de la proteína **
: Bibliorafía: (en qué parte del texto es citada esta bibliografía?????) 1.Beckmann,R.; Toye, A. M.; Smythe, J.S.; Antee, D.J.; Tanner, M.J.(2002)An N-terminal GFP tag does not alter the functional expression to the plasma membrane of red cell and kidney anion exchanger (AE1) in mammalian cells 2.Boiron, P.; Provost, F.(1990).Characterization of Nocardia, Rhodococcus and Gordona species by in vitro susceptibility testing.
3.Fulman, N;Bibi, E.(2009) Bacterial multidrug transport through the lens of the major facilitator superfamily
4.Gibert,S.; Bakalara,N.; Santarelli, X. (2000)Three-step chromatographic purification procedure for the production of a his-tag recombinant kinesin overexpressed in E. coli
5.Gurtler,V. Mayall, B.C.; Seviou,R. (2004)Can whole genome analysis refine the taxonomy of the genus Rhodococcus?
6.Fournier,H.; Hawari,J.; Halasz,A; Strager,S.H.; Mc Clay,K.R:; Masuda, H.; Hatzinger,P.B. (2009)Aerobic Biodegradation of N-Nitrosodimethylamine by the Propanotroph Rhodococcus ruber ENV425
7.Liu,Y.H.; Di,Y.M.; Zhou,Z.W.; Mo,S.L.; Zhou,S.F.(2009)Multidrug Resistance Associated Proteins and Implications in Drug Development
ANÁLISIS DE “DRUG RESISTANCE EFFLUX PROTEIN “ DE RHODOCOCCUS
iNGENIERÍA GENÉTICA DE MICROORGANISMOS
uNIVERSIDAD DE LEÓN
cRISTINA fERNÁNDEZ dÍEZ
Resumen:
Rhodococcus (los nombres de especies "cursiva") es un microorganismo que se adapta fácilmente a medios adversos y diversos por eso esta ampliamente distribuido y pertenece al grupo de los Actinomycetales?????, teniendo estructura bacilar.
Son un grupo de microorganismos que no esporulan y que no son móviles. Se secuenció el género (se secuencia una especie, no un género) en el 2006 (falta una referencia) conteniendo 9.7Mpb y contiene tres plásmidos lineales.
Se caracteriza a demás por su rápida velocidad de crecimiento y su ciclo de vida sencillo. (referencia)
Es un microorganismo Gram positivo que contiene varias especies entre las que se encuentra R. equi que produce enfermedades en los humanos, aunque la mayoría no son perjudiciales.
Rhodococcus es un género importante por su capacidad para catabolizar una gran gama de compuestos bioactivos, producir esteroides y participar en la formación de combustibles fósiles
Es un género que también se encarga de la biodegradación de contaminantes organicos.
El marco de lectura escogido corresponde a una drug resistance efflux protein que al parecer es una proteína trasmembrana que es resistente ante las sustancias extrañas ??????, fármacos o drogas que pueden alterar el funcionamiento normal de la célula.
La proteína es tiene un alto contenido en G+C (las proteínas no tiene alto ni bajo contenido en G+C)
INTRODUCCIÓN: (faltan referencias, no se puede escribir un trabajo sin referencias)
Rhodococcus (cursiva) es un género que pertenece a la familia (orden) de los Actinomicetales , son un subgrupo de las bacterias que tienen ácidos micólicos en la pared celular y se ha podido comprobar que tienen relación filogenética con otros géneros como Mycobacterium (cursiva) y Corynobacterium ( Corynebacterium y en cursiva) entre otras, a partir del RNA ribosomal 16S. (Gráfica1)
Varias especies han sido descritas a partir de las características de su membrana (????????) incluyendo genes implicados en la virulencia, en la degradación metabólica, análisis genéticos y organización de operones entre otros. Según estos datos las diferentes especies que se engloban en este género son: R. rhodochrous que incluye a R. bronchialis, , R. corallinus, R. equi, R. erythropolis, R. ruber, R. rubropertinctus y R. térrea, R. coprophilus. (todos los nombres deben ir en cursiva)
Los microorganismos que pertenecen al género Rhodococcus (cursiv) están generalmente muy distribuidos por el medio ambiente pudiéndose encontrar también en suelos, reservorios de agua, ríos y otros ambientes acuáticos.
Algunos microorganismos que pertenecen a éste género son capaces de generar enfermedades en los humanos, por lo que pueden ser considerados patógenos oportunistas.
Características generales del género: (referencias?)
(Hubiera sido conveniente hacer referencia a las caracteristicas del género definidas en el Bergey)
MATERIALES Y MÉTODOS:
Necesitamos, para empezar a trabajar, un plasmado ( plásmido?????) suicida que no puede replicarse en el huésped, como es el pOJ260 ( Imagen 1), es un plásmido de E. coli.
Así mismo también es necesario tener la secuencia de la proteína elegida para poder llevar a cabo los diferentes experimentos que nos indicarán finalmente la procedencia de la misma, su localización función etc,. ( Imagen 3)
(materiales y métodos muy escasos)
Análisis del gen que codifica para la proteína elegida:
- AMPLIFICACIÓN DEL GEN POR PCR:
Para ello necesitamos la secuencia de nucleótidos del gen para diseñar un primer directo a partir del extremo 5’ de la cadena complementaria y otro a partir del extremo 3’ de la cadena molde, pero a esta última, le damos la vuelta para hacerla en sentido 5’- 3’ y le quitamos el codón de stop (no lo tiene claro, se quita el codon de STOP para hacer una fusión génica) para que se pueda leer el primer completo.A esta amplificación le tenemos que poner sitios de corte para que el fragmento amplificado se pueda clonar en el plásmido suicida (si clona el gen en un plasmido suicida, no entiendo que va a hacer luego con él) que hemos elegido. En este caso ponemos sitios de corte con la enzima Hind III que pertenece a la región de clonación múltiple del plásmido suicida elegido.
( Diseño 1)
- AMPLIFICACIÓN DE FRAGMENTOS INTERNOS DEL GEN :
Para clonar un fragmento interno del gen lo primero que necesitamos es saber cuales pueden ser los mejores primers. Para averiguarlo nosotros utilizamos un programa informático (¿qué programa?) que estadísticamente te señala la mejor probabilidad, a parte de darte otras opciones.De la misma manera también nos indica la temperatura de los oligonucleótidos (temperatura de fusión) , su contenido en G+C y su tamaño.
Como el fragmento interno lo tenemos que introducir en el plásmido suicida les ponemos a los primers sitios de corte en los extremos 5’ que se corresponden a la enzima Eco RI para que el fragmento pueda ser clonado en el sitio de clonación múltiple del plásmido suicida.
(Diseño 2)
- DELECCIÓN DE UN FRAGMENTO INTERNO DEL GEN:(para qué va a hacer esto????) )
Para realizar la delección tenemos que quitar un número múltiplo de tres nucleótidos para que se pueda formar después RNAm que permita que se siga expresando el gen de abajo. Nosotros le hemos quitado un fragmento de 120 nucleótidos en la posición (781-901).Los primer que tenemos que realizar son cuatro, el primero y el segundo se realizan de forma habitual y el segundo y el tercero también pero teniendo en cuenta que tienen que estar flanqueando la zona de delección del gen.( Diseño3)
Análisis de la proteína elegida:
- AMPLIFICACIÓN DEL GEN CON COLAS DE HISTIDINA
Se utiliza una cola formada por 6 Histidinas para realizar purificaciones de la proteína por cromatografía de afinidad usando metales inmóviles sobre una matriz o por cromatografía con resinas de níquel.La histidina se añade en forma de nucleótidos para que cuando se produzca la traducción de la proteína el aminoácido en cuestión se exprese.
Una de las ventajas de esta técnica es que se puede utilizar incluso, aunque el DNA este desnaturalizado y en éste caso podremos eluir la proteína en cuestión con imidazol trabajando con un buffer fisiológico:PBS. Haga el favor de releer estas frases y encontrar los errores.
Las colas de Histidina sólo las colocamos en el extremo 5’ de la cadena molde.
Para sacar la proteína del DNA donde esta integrado le ponemos sitios de corte correspondientes a Hin III y así poder purificarlo. ( Diseño 4)
.
- MUTAGÉNESIS DIRIGIDA DEL GEN .
Mutamos un codon de la proteína que estamos tratando en una zona interna de la misma para ver que es lo que ocurre después. Que quiere decir con esta frase???Para ello debemos tener en cuenta que los cambios más significativos se dan con el cambio de la primera y segunda base.Debemos hacer cuatro primers y uno de ellos mutagénico, es el que va a llevar el cambio de base en su secuencia. Nosotros hemos hecho el cambio para el aminoácido leucina, lo hemos cambiado por la valina: cabiamos la primera base correspondiente con citosina por guanina.
Los primers 1y 4 se hacen de forma habitual pero el seguno es el que lleva el cambio de base y el tercero es su complementario.( Diseño 5)
- FUSIÓN GÉNICA ENTRE LA PROTEINA Y LA GFP:
La proteína GFP nos va a permitir obtener datos relacionados con su localización, dinámica e interacciones moleculares. Es una proteína que desde su descubrimiento ha sido utilizada en medicina y en investigación en general.Se considera una proteína de fusión porque no tiene función conocida. ?????????
Para llevar a cabo el proceso debemos hacer cuatro primers. El segundo debe llevar el inicio del gen del tercer primer y el tercero el inicio del gen del segundo. Es importarte quitar el codon de “stop” del segundo primer para que se puedan leer bien los primers sin que haya ningún paro. (Diseño 6)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
La proteína drug resistance efflux pertenece a la superfamilia Major Facilitator (Tabla1) que es una de las dos grandes familias de transportadores de membrana.( Fulman N.; Bibi,E. 2009).
Gracias a la fusión realizada entre nuestro gen y la gfp pudimos determinar, mediante irradación con luz ultavioleta, que nuestra proteína es una proteína transmembrana sin péptido líder (Gráfica 2), es una proteína integral que atraviesa la membrana varias veces conteniendo tres dominios principales, de los cuales, dos son hidrofilicos: citosólico y extracitosólico, y otro es hidrófobo, dominio transmembrana de interactuación con la bicapa lipídica.(Imagen 2 y Gráfica 3)
Es una proteína relacionada con la inactivación de las drogas, por lo que puede facilitar a la célula que la contenga el crecer en condiciones adversas y muy diversas. Drug-specific efflux (eg that of tetracycline) has been recognised as the major mechanism of resistance to this drug in Gram-negative bacteria.
Al realizar la delección de un fragmento interno del gen la proteína pierde su funcionalidad por lo que podemos sacar en conclusión que ese fragmento del gen es el que lleva la responsabilidad de que la proteína sea una molécula resistente al paso de sustacias perjudiciales o fármacos a la célula.Tiene claro el concepto de proteína de reflujo????
Por otra parte al hacer la mutación de una base de un codon que codifica para leuicina la funcionalidad de la proteína no varía aunque el fenotipo de la proteína cambia drásticamente, por lo que habremos alterado la conformación espacial de la mísma.
Adicionalmente también aparecen cepas silvestres que no llevan la mutación.
Es cortada por 21 enzimas de restricción modificación de las que menos cortes realizan son CNBr, Lys C, Lys N, NTCB y la prolina endopeptidasa.(Tabla 1).
Dentro de las características físico-químicas resaltamos la polaridad positiva en la prueba de Gram(me puede explicar esto????) y su hidrofobidad. (Gráficas 4, 5 y 6).
Al hacer la prueba de la proteína coiled-coil dio como resultado negativo, por lo tanto no podemos considerar que nuestra proteína tenga dos cadenas idénticas respecto a la secuencia de aminoácidos de la misma.( Gráfica 7)
Donde están las imágenes???????
Imágenes:
Imagen 1: plásmido suicida utilizado
Imagen 2: Disposición de proteína transmembrana
DISEÑO DE PRIMERS:
El marco de lectura elegido corresponde a la “drug resistance efflux protein”que se encuentra situada entre 3710-5464 nucleótidos de la secuencia completa que corresponde a:
Secuencia de aminoácidos:
>PNLQRIYPSGQRRLWWNRGSVVSRRATGRKAHTMTVESLEDEPRVGRREWIGLGVLAAGLSLIVVDGTIVNVSLPVIIDELGLDLTDAQWINSIYSVVFAALLLTAGRLGDRLGRRMLFVAGVVVFIGGSLMAAASESSTALIVARVVQGVGGALVLPCTLSTVNATFRGRDRAIAFGVWGAVISGMAAVGPLLGGWLTTSFTWPWIFLVNVPIGILVIIGAFLTVPETRAKITVPGLDVVGLLLSAIGFGALIFALIEGQTIGWWKPIADLHVFGATWPSTAPISATPVVAAVGVVALIGFVVWERHRARIRYSAILDLGLFRFHTFSWGNCTAMAVAIGEFGLLLVLPLFLVNAYGLSTLGAGYVLAVMALGAFASGAAARHVTARFGSPRTVMLGLALEVVGVLAFALYLRPSSAAWLLALLLAIYGLGLGLASAQLTGTVLVDIPTSESGQGSATQSTVRQLGAALGTAILGTVLSLGLAHALTDRLEPVALPPQVESGLVDSTRDSAGGTIPPIREQGDHGRLGPAGPETADALSEGFADATRWSLFVAAGFLAVGLATATRLQHRRPEDDDAAATATA
Secuencia de nucleótidos(3710/5464):
>ccgaatctgcaacggatttacccgtcggggcagcgtcggctctggtggaatcgcggtagcgtcgtatcgagacgcgccaccgggagaaaggcgcacaccatgaccgtggaatcgctcgaggacgaaccgcgggtaggccgccgggagtggatagggctcggcgtcctcgccgccggtctgtcgctcatcgtcgtcgacggcaccatcgtcaacgtctcgctcccggtgatcatcgacgaactgggtctcgacctcaccgacgcccagtggatcaacagcatctactcggtggtgttcgcagcactgctgctcacggccggccgcctcggcgaccggctgggccgccggatgctcttcgtcgccggtgtcgtcgtgttcatcggcggcagcctgatggcggcggcgtcggagtcctcgacggcgctgatcgtcgcccgcgtcgtgcagggcgtcggcggcgcgctggtgctgccgtgcacgctgtcgacggtcaacgccacgttccgcggacgcgaccgggccatcgcgttcggagtgtggggcgcggtcatctccggcatggcggccgtgggcccgctgctcggcggctggctcacgacgtcgttcacgtggccgtggatcttcctggtgaacgtgccgatcggcatcctcgtcatcatcggcgcgtttctcacggtccccgagacccgggcgaagatcaccgtgcccggactcgacgtggtgggtctgctgctgagcgcaatcggtttcggcgcgttgatcttcgcgctcatcgagggccagaccatcggttggtggaagcccatcgcggatctccacgtgttcggggcgacgtggccgtcgacggcgccgatctcggccaccccggtcgtcgccgccgtcggcgtcgtcgcactcatcggattcgtcgtgtgggagcggcaccgggcgcggatccggtactccgccatcctcgatctggggctcttccggttccacaccttcagctggggcaactgcaccgcgatggcggtcgcgatcggcgagttcggtctgctgctggtgctaccgctgttcctcgtcaacgcgtacgggctcagcacgctgggcgctggctacgtgctcgcggtgatggcgctcggcgcgttcgcgtccggagcggccgcgcgtcacgtcaccgcccgcttcggttccccgcgcaccgtgatgctcggtctggcactcgaggtggtcggcgtcctggcgttcgcgctgtacctgcggccgtcgtcggcggcgtggctgctggcgctgctgctcgcgatctacggcctcgggctggggctcgcgtcggcgcagctcaccggcacggttctcgtcgacatcccgacgtcggagtccggccagggatcggcgacgcagagcacggtccgtcagctgggcgccgcgctgggcactgcaatcctggggaccgtgctctcgctcgggctcgcgcacgccctcaccgaccgcctcgaaccggtggcgctgccgccgcaggtggagtcgggactcgtcgacagcacccgcgactcggccggcggcaccatcccaccgatccgggagcagggcgaccacggcaggctcggcccggccggacccgagaccgccgacgcgctgtccgagggcttcgccgacgccacccgctggtcgctgttcgtcgcggccggattcctcgccgtcggactcgcaaccgccacccgactgcagcaccgacgcccggaggacgacgacgccgcggccaccgccacggcgtag
Imagen 3: Selección de marcos de lectura de la secuencia dada
Análisis del gen que codifica para la proteína elegida::
Diseño 1: primers para la amplificación del gen
1 CCGAATCTGCAACGGATTTACCCGTCGGGGCAGCGTCGGCTCTGGTGGAATCGCGGTAGC
1 GGCTTAGACGTTGCCTAAATGGGCAGCCCCGTCGCAGCCGAGACCACCTTAGCGCCATCG
61 GTCGTATCGAGACGCGCCACCGGGAGAAAGGCGCACACCATGACCGTGGAATCGCTCGAG
61 CAGCATAGCTCTGCGCGGTGGCCCTCTTTCCGCGTGTGGTACTGGCACCTTAGCGAGCTC
1561 GAGCAGGGCGACCACGGCAGGCTCGGCCCGGCCGGACCCGAGACCGCCGACGCGCTGTCC
1561 CTCGTCCCGCTGGTGCCGTCCGAGCCGGGCCGGCCTGGGCTCTGGCGGCTGCGCGACAGG
1621 GAGGGCTTCGCCGACGCCACCCGCTGGTCGCTGTTCGTCGCGGCCGGATTCCTCGCCGTC
1621 CTCCCGAAGCGGCTGCGGTGGGCGACCAGCGACAAGCAGCGCCGGCCTAAGGAGCGGCAG
1628 GGACTCGCAACCGCCACCCGACTGCAGCACCGACGCCCGGAGGACGACGACGCCGCGGCC
1628 CCTGAGCGTTGGCGGTGGGCTGACGTCGTGGCTGCGGGCCTCCTGCTGCTGCGGCGCCGG
1741 ACCGCCACGGCGTAG
1741 TGGCGGTGCCGCATC
Primer directo: 5’-CCCAAGCTTCCGAATCTGCAACGG-3’
Primer inverso: 5’-CCCAAGCTTCGCCGTGGCGG-3’
Sitios de corte para Hind III
Diseño 2: primers para la amplificación interna del gen
PRIMER 2: 5’-CGGAATTCGCGAACACCACCGAGTAGAT-3’
La enzima de restricción usada es la Eco RI
Diseño 3: Delección de un fragmento interno del gen
1 CCGAATCTGCAACGGATTTACCCGTCGGGGCAGCGTCGGCTCTGGTGGAATCGCGGTAGC
1 GGCTTAGACGTTGCCTAAATGGGCAGCCCCGTCGCAGCCGAGACCACCTTAGCGCCATCG
61 GTCGTATCGAGACGCGCCACCGGGAGAAAGGCGCACACCATGACCGTGGAATCGCTCGAG
61 CAGCATAGCTCTGCGCGGTGGCCCTCTTTCCGCGTGTGGTACTGGCACCTTAGCGAGCTC
121 GACGAACCGCGGGTAGGCCGCCGGGAGTGGATAGGGCTCGGCGTCCTCGCCGCCGGTCTG
121 CTGCTTGGCGCCCATCCGGCGGCCCTCACCTATCCCGAGCCGCAGGAGCGGCGGCCAGAC
661 GGCGCGTTTCTCACGGTCCCCGAGACCCGGGCGAAGATCACCGTGCCCGGACTCGACGTG
661 CCGCGCAAAGAGTGCCAGGGGCTCTGGGCCCGCTTCTAGTGGCACGGGCCTGAGCTGCAC
721 GTGGGTCTGCTGCTGAGCGCAATCGGTTTCGGCGCGTTGATCTTCGCGCTCATCGAGGGC
721 CACCCAGACGACGACTCGCGTTAGCCAAAGCCGCGCAACTAGAAGCGCGAGTAGCTCCCG
781 CAGACCATCGGTTGGTGGAAGCCCATCGCGGATCTCCACGTGTTCGGGGCGACGTGGCCG
781 GTCTGGTAGCCAACCACCTTCGGGTAGCGCCTAGAGGTGCACAAGCCCCGCTGCACCGGC
841 TCGACGGCGCCGATCTCGGCCACCCCGGTCGTCGCCGCCGTCGGCGTCGTCGCACTCATC
841 AGCTGCCGCGGCTAGAGCCGGTGGGGCCAGCAGCGGCGGCAGCCGCAGCAGCGTGAGTAG
901 GGATTCGTCGTGTGGGAGCGGCACCGGGCGCGGATCCGGTACTCCGCCATCCTCGATCTG
901 CCTAAGCAGCACACCCTCGCCGTGGCCCGCGCCTAGGCCATGAGGCGGTAGGAGCTAGAC
961 GGGCTCTTCCGGTTCCACACCTTCAGCTGGGGCAACTGCACCGCGATGGCGGTCGCGATC
961 CCCGAGAAGGCCAAGGTGTGGAAGTCGACCCCGTTGACGTGGCGCTACCGCCAGCGCTAG
1021 GGCGAGTTCGGTCTGCTGCTGGTGCTACCGCTGTTCCTCGTCAACGCGTACGGGCTCAGC
1021 CCGCTCAAGCCAGACGACGACCACGATGGCGACAAGGAGCAGTTGCGCATGCCCGAGTCG
1621 GAGGGCTTCGCCGACGCCACCCGCTGGTCGCTGTTCGTCGCGGCCGGATTCCTCGCCGTC
1621 CTCCCGAAGCGGCTGCGGTGGGCGACCAGCGACAAGCAGCGCCGGCCTAAGGAGCGGCAG
1681 GGACTCGCAACCGCCACCCGACTGCAGCACCGACGCCCGGAGGACGACGACGCCGCGGCC
1681 CCTGAGCGTTGGCGGTGGGCTGACGTCGTGGCTGCGGGCCTCCTGCTGCTGCGGCGCCGG
1741 ACCGCCACGGCGTAG
1741 TGGCGGTGCCGCATC
PRIMER 1: 5’-CGGGATCC-ATG-CCGAATCTGCAACGGATTTAC-3’
PRIMER 2: 5’-GGTGTGGAACCGGAAGAGCCCGCCCTCGATGAGCGCGAAGATCAACG-3’
PRIMER 3: 5’- CGTTGATCTTCGCGCTCATCGAGGGCGGGCTCTTCCGGTTCCACACC-3’
PRIMER 4: 5’-CGGGATCCCGCCGTGGCGGT-3’
Sitio de corte Bam HI
Análisis de la proteína:
Diseño 4: purificación con colas de histidina
1 CCGAATCTGCAACGGATTTACCCGTCGGGGCAGCGTCGGCTCTGGTGGAATCGCGGTAGC
1 GGCTTAGACGTTGCCTAAATGGGCAGCCCCGTCGCAGCCGAGACCACCTTAGCGCCATCG
61 GTCGTATCGAGACGCGCCACCGGGAGAAAGGCGCACACCATGACCGTGGAATCGCTCGAG
61 CAGCATAGCTCTGCGCGGTGGCCCTCTTTCCGCGTGTGGTACTGGCACCTTAGCGAGCTC
121 GACGAACCGCGGGTAGGCCGCCGGGAGTGGATAGGGCTCGGCGTCCTCGCCGCCGGTCTG
121 CTGCTTGGCGCCCATCCGGCGGCCCTCACCTATCCCGAGCCGCAGGAGCGGCGGCCAGAC
1561 GAGCAGGGCGACCACGGCAGGCTCGGCCCGGCCGGACCCGAGACCGCCGACGCGCTGTCC
1561 CTCGTCCCGCTGGTGCCGTCCGAGCCGGGCCGGCCTGGGCTCTGGCGGCTGCGCGACAGG
1621 GAGGGCTTCGCCGACGCCACCCGCTGGTCGCTGTTCGTCGCGGCCGGATTCCTCGCCGTC
1621 CTCCCGAAGCGGCTGCGGTGGGCGACCAGCGACAAGCAGCGCCGGCCTAAGGAGCGGCAG
1628 GGACTCGCAACCGCCACCCGACTGCAGCACCGACGCCCGGAGGACGACGACGCCGCGGCC
1628 CCTGAGCGTTGGCGGTGGGCTGACGTCGTGGCTGCGGGCCTCCTGCTGCTGCGGCGCCGG
1741 ACCGCCACGGCGTAG
1741 TGGCGGTGCCGCATC
Primer directo: 5’-CCCAAGCTTCCGAATCTGCAACGG-3’
Primer inverso:
5’-CCCAAGCTTcaccaccaccaccaccaccaccaccaccaccaccaccaCGCCGTGGCGG-3’
EL CODÓN QUE CODIFICA PARA LA HYS ES CAC
EL SITIO DE CORTE ES EL hIND iii
Diseño 5: mutagénesis dirigida de un codón
Secuencia de drug resistance efflux protein
1 CCGAATCTGCAACGGATTTACCCGTCGGGGCAGCGTCGGCTCTGGTGGAATCGCGGTAGC
1 GGCTTAGACGTTGCCTAAATGGGCAGCCCCGTCGCAGCCGAGACCACCTTAGCGCCATCG
61 GTCGTATCGAGACGCGCCACCGGGAGAAAGGCGCACACCATGACCGTGGAATCGCTCGAG
61 CAGCATAGCTCTGCGCGGTGGCCCTCTTTCCGCGTGTGGTACTGGCACCTTAGCGAGCTC
121 GACGAACCGCGGGTAGGCCGCCGGGAGTGGATAGGGCTCGGCGTCCTCGCCGCCGGTCTG
121 CTGCTTGGCGCCCATCCGGCGGCCCTCACCTATCCCGAGCCGCAGGAGCGGCGGCCAGAC
1621 GAGGGCTTCGCCGACGCCACCCGCTGGTCGCTGTTCGTCGCGGCCGGATTCCTCGCCGTC
1621 CTCCCGAAGCGGCTGCGGTGGGCGACCAGCGACAAGCAGCGCCGGCCTAAGGAGCGGCAG
1681 GGACTCGCAACCGCCACCCGACTGCAGCACCGACGCCCGGAGGACGACGACGCCGCGGCC
1681 CCTGAGCGTTGGCGGTGGGCTGACGTCGTGGCTGCGGGCCTCCTGCTGCTGCGGCGCCGG
1741 ACCGCCACGGCGTAG
1741 TGGCGGTGCCGCATC
Secuencia de la gfp:
1 GATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGG
1 CTACTCATTTCCTCTTCTTGAAAAGTGACCTCAACAGGGTTAAGAACAACTTAATCTACC
61 TGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGG
61 ACTACAATTACCCGTGTTTAAAAGACAGTCACCTCTCCCACTTCCACTACGTTGTATGCC
121 AAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACT
121 TTTTGAATGGGAATTTAAATAAACGTGATGACCTTTTGATGGACAAGGTACCGGTTGTGA
661 TCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAATAA
661 AGAACTCAAACATTGTCGACGACCCTAATGTGTACCGTACCTACTTGATATGTTTATT
Primer 1: 5’-GCTCTAGACCGAATCTGCAACG-3’
PRIMER 2: 5’-CTCCTTTACTCATCCGCCGTGGCGG-3’
PRIMER 3: 5’-CCGCCACGGCGGATGAGTAAAGGAG-3’
PRIMER 4: 5’-GCTCTAGATTATTTGTATAG-3’
Sitios de corte para Xba I
TABLAS Y DATOS FOLOGENÉTICOS:
Secuencia de proteínas usadas en el alineamiento:
>Corynebacterium amycolatum SK46
MSNPASNTSLNVNPRESAASKAAAPNPKAAVPVLLFSFVFCLVLDNGFKFMTKPIAESLDLSVSTASLQA
TLAGILIGIGAVVYAALADSISIRKLMIVGIGFVAVGSLLGYFFQGVWPMVLTARIIQTAGLAAAETLYV
IYVTKYLSPEDQKTYLGFSTAAFQAALLIGTLTSGIVATYVSWPAMFLISLILIVAIPFLIKTVPEEQQQ
KSHLDIFGLFLIAVIATAVMLFMQKFQWWWLVVAALGVALFVWHIRAHDNAVVSPSFFTNARYVCALIVV
LVVYMVQLGYSAILLPYMVDELYGINLDGAAYILAPGYLCAVIVGVMSGKVAKFLPSKQAIVVAISIIIV
ALLIPAVLPGAGVATVIVSMILFPSGFALMYAPLVATALQSIPAAKSGVAIGFYNLTINIAVPVGIALTA
MLVDSRPAFFSALSIAQSEAEGVSATIAWLLALMAVVGLLVYVISDRIINDTAENREKVHA
>Corynebacterium amycolatum SK46
MSNPASNTSLNVNPRESAASKAAAPNPKAAVPVLLFSFVFCLVLDNGFKFMTKPIAESLDLSVSTASLQA
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ALLIPAVLPGAGVATVIVSMILFPSGFALMYAPLVATALQSIPAAKSGVAIGFYNLTINIAVPVGIALTA
MLVDSRPAFFSALSIAQSEAEGVSATIAWLLALMAVVGLLVYVISDRIINDTAENREKVHA
>Nitrobacter sp. Nb-311A
MAWFILFLAGLMEVGWAIGLKYTEGLTRLVPSVLTLTAMAISMGLLGLALKTLPIGTAYAVWTGIGAVGT
AILGIVLFGDPATMARLACIGLIVAGIAGLKLVT
>Mycobacterium tuberculosis H37Rv
MTETASETGSWRELLSRYLGTSIVLAGGVALYATNEFLTISLLPSTIADIGGSRLYAWVTTLYLVGSVVA
ATTVNTMLLRVGARSSYLMGLAVFGLASLVCAAAPSMQILVAGRTLQGIAGGLLAGLGYALINSTLPKSL
WTRGSALVSAMWGVATLIGPATGGLFAQLGLWRWAFGVMTLLTALMAMLVPVALGAGGVGPGGETPVGST
HKVPVWSLLLMGAAALAISVAALPNYLVQTAGLLAAAALLVAVFVVVDWRIHAAVLPPSVFGSGPLKWIY
LTMSVQMIAAMVDTYVPLFGQRLGHLTPVAAGFLGAALAVGWTVGEVASASLNSARVIGHVVAAAPLVMA
SGLALGAVTQRADAPVGIIALWALALLIIGTGIGIAWPHLTVRAMDSVADPAESSAAAAAINVVQLISGA
FGAGLAGVVVNTAKGGEVAAARGLYMAFTVLAAAGVIASYQATHRDRRLPR
>Acinetobacter baumannii AYE
MSYLYLAIAIACEVIATSALKASQGFTVPIPSIITVVGYAVAFYLLSLTLKTIPIGIAYAIWSGAGIILI
SAIGWIFYKQHLDLAACIGLALMIAGIVIINVFSKNTHL
>Acinetobacter sp. ADP1
MMQKVWSISGRSIAVSALALALAACQSMRGPEPVVKADIPTSYTYNASGQSIAEQGYKDFFSDPRLLQVI
ELALNNNRDLRTAALNIQRAQQQYQITENNQLPTIGASGSAIRQVSITRDPNNPYSTFQVGLGVTAYELD
FWGRVRSLKDAALDNYLATQSTRDTTQISLVSQVAQAWLSYSFAVANLKLADQTLKAQLDSYNLNKKRFD
VGIDSEVPLRQAQISVETARNDVANYKTQIVQAQNLLNLLVGQSVPQNLLPNQPVKSITRQNVFSTGLPS
DLLNNRPDVKSAEYQLSAAGANIGAAKAALFPTISLTGSAGYASTQLSDLFKSGAGVWSIGPSLELPIFD
WGTRRANIKISETDQKIALSNYEKSIQSAFREVNDALATRANIGDRISAQRRLVDATNTTYSLSNARFRA
GIDNYLTVLDAQRTSYSAEQGLLLLEQANLNNQIELYKTLGGGLKANTTDTVVHQPSSADLKKK
>Mycobacterium ulcerans Agy99
MLSTAMDEAHCTPAEVAPPDTRTGTSSPGEHVYPDRLDAGLLRIAGVCVLASLMSVLDATVVGIAQRTFI
IEFDSTQAVVAWTMTGYTLALATVIPVAGWAADRFGTKRLWMGSVLAFALGSLLCALAPNILSLIFFRVL
QGVGGGMLMPLGFIILTRAAGPKRLGRLMAAIGIPMLLGPIGGPILGGWLISSFGWHWIFLVNLPIGLAA
FALAAITFPADRPVPSESFDVIGVLLLSPGLAAFLLALSLIPDRGTVADRYVLIPVIAGLSLIGGFAWHA
WHRADHPLIDLHLFNNSVVTQANLTLLAFAAAYFGSSLLIPTYLQQVLHQTPMQSGLYLIPQGLGAMLTM
PIASAFMDRRGPGKSVLLGIVLIAVGLAMFTFGVATRAQYLPTLLVGLAIMGMGTGCTMMPLAGAAVLTL
KPREIARGSTLISVTQQVGGSIGTALMATILTNQFNRSDNIWVANKVATLEQNAAARGVTVDPSGLPPQA
LTPDFADNVMHDLSHAYTVVFGVVVVLVVSTLIPAASLPKTPAAAPASFEQHHCDTQYGVHRV
>Mycobacterium tuberculosis C
MTGIDMLGNAMVEACPAEGDAPVPITPAGRPRSGQRSYPDRLDVGLLRTAGVCVLASVMAHVDVTVVSVA
QRTFVADFGSTQAVVAWTMTGYMLALATVIPTAGWAADRFGTRRLFMGSVLAFTLGSLLCAVAPNILLLI
IFRVVQGFGGGMLTPVSFAILAREAGPKRLGRVMAVVGIPMLLGPVGGPILGGWLIGAYGWRWIFLVNLP
VGLSALVLAAIVFPRDRPAASENFDYMGLLLLSPGLATFLFGVSSSPARGTMADRHVLIPAITGLALIAA
FVAHSWYRTEHPLIDMRLFQNRAVAQANMTMTVLSLGLFGSFLLLPSYLQQVLHQSPMQSGVHIIPQGLG
AMLAMPIAGAMMDRRGPAKIVLVGIMLIAAGLGTFAFGVARQADYLPILPTGLAIMGMGMVCSMMPLSGA
AVQTLAPHQIARGSTLISVNQQVGGSIGTALMSVLLTYQFNHSEIIATAKKVALTPESGAGRGAAVDPSS
LPRQTNFAAQLLHDLSHAYAVVFVIATALVVSTLIPAAFLPKQQASHRRAPLLSA
:
Alineamiento de protínas:
Gráfica 1: Árbol filogenético
PROPIEDADES DE LA DRUG RESISTANCE EFFLUX PROTEIN:
Gráfica 3: Zonas transmembrana de la proteína
Gráfica 2: Proteína sin péptido líder
Gráfica 7: Proteína no coiled-coil
características fisico-químicas:
Valor de los aminoácidos:
Ala: 89.000 Arg: 174.000 Asn: 132.000 Asp: 133.000 Cys: 121.000 Gln: 146.000
Glu: 147.000 Gly: 75.000 His: 155.000 Ile: 131.000 Leu: 131.000 Lys: 146.000
Met: 149.000 Phe: 165.000 Pro: 115.000 Ser: 105.000 Thr: 119.000 Trp: 204.000
Tyr: 181.000 Val: 117.000 : 132.500 : 146.500 : 136.750
Gráfica 4:Valor individual de los aminoácidos según su peso molecular
Gráfica 5: Hidrofobidad de la proteína
Gráfica 6: Polaridad de la proteína
Tablas:
Tabla 1 : Enzimas que cortan la secuencia de la proteína **
:
Bibliorafía: (en qué parte del texto es citada esta bibliografía?????)
1. Beckmann,R.; Toye, A. M.; Smythe, J.S.; Antee, D.J.; Tanner, M.J.(2002) An N-terminal GFP tag does not alter the functional expression to the plasma membrane of red cell and kidney anion exchanger (AE1) in mammalian cells
2. Boiron, P.; Provost, F.(1990). Characterization of Nocardia, Rhodococcus and Gordona species by in vitro susceptibility testing.
3. Fulman, N; Bibi, E.(2009) Bacterial multidrug transport through the lens of the major facilitator superfamily
4. Gibert,S.; Bakalara,N.; Santarelli, X. (2000)Three-step chromatographic purification procedure for the production of a his-tag recombinant kinesin overexpressed in E. coli
5. Gurtler,V. Mayall, B.C.; Seviou,R. (2004) Can whole genome analysis refine the taxonomy of the genus Rhodococcus?
6. Fournier,H.; Hawari,J.; Halasz,A; Strager,S.H.; Mc Clay,K.R:; Masuda, H.; Hatzinger,P.B. (2009) Aerobic Biodegradation of N-Nitrosodimethylamine by the Propanotroph Rhodococcus ruber ENV425
7. Liu,Y.H.; Di,Y.M.; Zhou,Z.W.; Mo,S.L.; Zhou,S.F.(2009) Multidrug Resistance Associated Proteins and Implications in Drug Development